En
este trabajo se ha pretendido generar una guía de diagnosis de la
enfermedad del chancro del castaño, a través de la revisión bibliografica, con el objetivo de dar a conocer la
metodología de trabajo de muchos patologos vegetales, trabajo que a título personal nos parece fundamental en el desarrollo del conocimiento forestal
Un saludo
Introducción
El chancro del castaño es una enfermedad producida por un ascomiceto identificado en 1906 como Diaporthe parasitica (Murril) y que en posteriores revisiones taxonómicas se renombró como Endothia parasitica. Finalmente, en 1978 Barr en un nuevo estudio del orden Diaporthales define el género como Cryphonectria y a la especie como Cryphonectria parasítica (Murr.) Barr. (Barr, 1978). Actualmente C. parasítica se encuentra extendido por todos los castañares de la provincia de Galicia y Castilla y León, en mayor o menor intensidad, y está catalogado como enfermedad de cuarentena. Dada la repercusión económica del C. parsitica sobre los castañares del noroeste de la península y ante la variabilidad de enfermedades presentes en el castaño, el presente trabajo pretende presentar una propuesta de reconocimiento del agente causante del chancro del castaño.
Metodología del diagnóstico
-
Presencia de ramas muertas
con hojas marchitas de color marrón
- Presencia de chancros en el
tronco ramas y brotes. Se reconoce la aparición de un chancro por
enrojecimiento e hinchazón de la corteza. Posteriormente la corteza se rompe y
se abre en fracturas longitudinales.
-
Sobre el chancro pueden
apreciarse pústulas de color amarillo o naranja, sobre todo cuando el clima es
especialmente húmedo.
-
Presencia de protuberancias
acuosas por debajo del chancro.
-
Desarrollo de micelio
amarillo-parduzco en forma de abanico sobre la corteza.
-
Las muestras se recogen de
la zona de avance del hongo situada en la corteza del árbol.
-
Dichas muestras están
compuestas por tiras de corteza lesionada que incluyan zona subcortical.
-
Estas muestras se llevan a
laboratorio y se conservan a 4 ºC.
Opción A
-
Recogemos las tiras de
corteza de la cámara y cortamos fragmentos de 3x2 cm
- Realizamos una desinfección
superficial con un tratamiento de hipoclorito sódico (lejía) al 50 % en
agitación durante 30 ´
-
Después lavamos con agua
destilada estéril durante 30 ´ y en agitación.
-
Lavado con etanol y luego
con lejía al 50 % respectivamente
- Finalmente sembrar en medio
de cultivo PDA modificado con metionina (100 mg/l) y con biotina (1mg/l). A
este medio de cultivo semiselectivo lo denominaremos PDAmb.
-
Introducimos las placas
en oscuridad a 24 ± 1 ºC durante 4-5
días de incubación.
- Finalmente trasferimos un
fragmento de micelio a medio PDA y volvemos a incubar en las mismas
condiciones, consiguiendo cultivos puros.
Opción B
- Se recogen pequeños trozos
de corteza de 1 cm², tomados del margen del chancro y se siembran, después de
ser lavados previamente en agua estéril, en medio PDAmb bajo luz ultravioleta
con un fotoperiodo de 12 horas, durante 10-15 días.
- Tras este intervalo de
tiempo observamos un micelio blanco que posteriormente se torna amarillo y con
abundante producción de picnidios en las áreas de micelio joven.
-
El resultado es una placa
que muestra anillos concéntricos de picnidios separados por micelio estéril.
Identificación
-
Sobre las zonas más viejas
de los chancros el hongo forma los cuerpos fructíferos (conidiomas picnidiales
o picnidios) muy pequeños y apreciables con una lupa, de color amarillento o
naranja, en el interior de los cuales se forman las esporas asexuales o
conidios.
-
Cuando la humedad es
suficiente los conidios exudan de los picnidios en forma de cirros anaranjados.
Esto puede observarse tras colocar las muestras traídas del campo en cámara
húmeda a los 3-4 días
-
Una vez que conseguimos
aislar al patógeno en el medio de cultivo deberemos observar un micelio blanco
y a los pocos días los primeros cirros saliendo de los picnidios.
Morfología
-
Picnidios de color
amarillento, con un ostiolo y de tamaño variable hasta 300 micras.
-
De la pared interna de los
picnidios surgen conidióforos ramificados, tabicados, hialinos, de superficie
lisa, con una longitud de hasta 60 micras y una anchura de 1,5 micras.
- Las células conidiógenas
son enteroblásticas y lo cirros amarillentos contienen conidios hialinos,
rectos o ligeramente curvados, unicelulares y redondeados en sus extremos con
un tamaño de 3-5 x 1-1,5 micras. Las masas de conidios aparecen en primavera.
- Las formas sexuales que
surgen en verano y en otoño se agrupan en estromas de entre 10 a 20 peritecios
globosos con un cuello alargado, de color marrón oscuro, que aparece de color
negro en el interior del estroma, y tamaño hasta 400 micrómetros.
-
Las ascas son alargadas
(32.55 x 7-8,5 micras) unitunicadas y con 8 ascosporas.
-
Las ascosporas son
elípticas, redondeadas en sus extremos, con un tabique central poco constreñido
y un tamaño entre 7-12 x 3-5,5 micras.
o Crecimiento
muy rápido en PDA
o Micelio
de color anaranjado
o Formación
de abundantes picnidios
o Crecimiento
en PDA del micelio sobre celofán y se mantiene en oscuridad a 24 ± 1 ºC
o Cuando
el micelio cubre toda la placa se retira el celofán y el micelio se liofiliza.
o Con
el material liofilizado se realiza el método de extracción con celulosa propuesto
por MORRIS Y DODS 1979
§ Se
homogeniza con GPS buffer y con 20 g glass
beads durante 4 minutos.
§ Después
se añade:
·
1 ml de 10 %SDS
·
0,2 ml de mercaptoetanol
·
10 ml de agua saturada con
fenol (contiene 0,1 % de 8-hidroxiquinolina.
·
10 ml de
cloroformo-pentanol (25:1)
§ Este
preparado se remueve de vez en cuando para formar y mantener una emulsión
durante 30 minutos en hielo
§ Posteriormente
se centrifuga y se recoge la fase acuosa que contiene las partículas de ácido
nucleico.
o Finalmente
se realiza una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % en tampón TBE 1 X a
100 voltios durante 60 min.
§ Control
positivo, Suministrado por el Dr Cortesi
§ Marcador landa hind III
o El
gel se introduce en una solución de Bromuro de etidio durante 30 min., se
captura la imagen con el sistema de documentación SYNGENE. El resultado se
analiza mediante el programa de densiometría 1-D- Manager (TDI , Madrid).
o Método
de compatibilidad vegetativa barrera fusión (Medio PDAg descrito por POWEL,
1995)
§ Caldo
de patata dextrosa (24 g/l)
§ Extracto
de malta (7g/l)
§ Extracto
de levadura (2g/l)
§ Ácido
tánico (0,8 g/l)
§ Agar
(20 g/l)
§ Colorante
bromocresol verde (50mg/l), facilita la observación de la barrera formada entre
los aislamientos incompatibles. ( Basado en la capacidad del hongo para
anastomosarse).
o Dos
aislamientos se consideran compatibles cuando los micelios enfrentados se
fusionan completamente
o Una
reacción incompatible se aprecia por la aparición de una barrera o línea negra entre
dos micelios. Esta línea se observa en la base de la placa petri.
o Finalmente
se estima la diversidad de los tipos de compatibilidad vegetativa.
Referencias bibliográficas
-
AGUÍN, O.; MATA, M.;
MANSILLA, J. P.; MARTÍN, A. B.; SIERRA, J. M. 2005 Distribución y diversidad de
los tipos de compatibilidad vegetativa de Cryphonectria
parasitica (Murrill) Barr en castaños de Castilla y León, Bol. San. Veg.
Plagas, 31: 287-297
-
MORRIS,
T. J. y DODDS, J. A. 1979. Isolation and analysis of double-stranded RNA from
virus-infected plant
and fungal tissue. Phytopathology, 69:854-858
-
GARCIA, P.; MONTE, E.;
Fitopatología del Castaño
-
EPPO Quarentine pest. Crhyponectria parasitica
-
CMI
Descriptions of patogenic Fungi and Bacteria No. 704
-
POWELL,
W. A. 1995. Vegetative incompatibility and mycelial death of Cryphonectria parasitica detected with a
pH indicator. Mycologia, 87: 738-741
